Gli ovuli vengono trasferiti in una provetta, e messi in incubatore, a 37° C: alla provetta vanno aggiunti gli spermatozoi preparati. La preparazione degli spermatozoi consiste in un processo che permette di isolare quelli con migliore capacità fecondante. Se la qualità del seme è sufficiente l´inseminazione consiste nell´aggiungere alla provetta contenente l´ovulo, 100.000 spermatozoi mobili (FIV-ET). Se la qualità del seme non è sufficiente o in caso di mancata fecondazione in vitro,
un singolo spermatozoo viene iniettato nell´ovulo (ICSI).

Dopo 20 ore dall´inseminazione nell´ovulo, si può osservare la presenza dei due pronuclei, il pronucleo maschile e il pronucleo femminile (zigote). Generalmente due zigoti, massimo tre vengono mantenuti
in coltura per due o tre giorni. Da essi si formano con divisione cellulare gli embrioni che saranno
poi trasferiti in utero.

Gli zigoti sovrannumerari vengono crioconservati e utilizzati per un ciclo successivo o per una seconda gravidanza.